第二种方法是什么？

通过体外游离系统翻译找到目标基因的mRNA后，可以通过以下步骤合成cDNA的第一链：

1） 向 ependorf 管中加入 50 pmol L 的 32 PDNTP 和 1 mg ml mRNA 10 L （10 g）、100 ml mol 甲基氢氧化汞 1 L，在室温下反应 L 0 分钟使 RNA 变性。

2）加入100ml巯基乙醇2L和RNA酶抑制剂10ml 2L，在室温下放置5分钟。-巯基乙醇具有稳定逆转录酶活性的作用。

3）加入1mgml引物01igo DT（12 18 mers）10L、1mol L、11 mol l KC7 L、250 ml Mol L MgCl22 L，加4种DNTP各20ml，逆转录酶2 L（40单位），加水至50 L，混匀，反应42 1 3 h。

4）加入EDTA（停止反应，然后加入150ml mol NaOH 25 L，65反应1 h，或37 8 h水解mRNA模板，得到cDNA的第一链，然后加入1 ml mol l，各25 L以中和其pH值。

5）测定放射性并计算DNA的合成量。事实上，cDNA第一条链的产量往往不超过poltamRNA量的10%至30%。

6）用等体积的苯酚-氯仿提取，取水相，用SephadexG-100离心柱色谱法（见第6章）将cDNA与剩余的dNTP分离，并在双倍体积的95冷乙醇中沉淀。

7）合成cDNA的第一链在碱性琼脂糖凝胶上电泳，以末端标记的pbr322限制性片段为分子量标准品，电泳后铺上X射线片，进行放射自显影，确定cDNA第一链的大小。

2：第二股的合成。

答：第一链合成完成后，直接进行第二链的合成。 它们在第一链合成系统中单独添加。

第二链缓冲液 40 L，DNA 聚合酶 23

rnase h

加水至100升

B：14-16 2小时。 （反应时间延长至3-4小时，>3kb）。

C：70,10min，慢速离心，置于冰浴中。

D：向样品管中加入T4DNA聚合酶2,37，静置10分钟。

E：向该样品管中加入 4 L 500 mm EDTA，置于冰浴上。

f：向上清液中等体积加入苯酚氯仿异戊醇，12000g，3min。

G：将上清液转移到干净的试管中，2 V乙醇，1 10 V醋酸钠，-20 30 min沉淀，12000 g，收集沉淀15 min，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，并复溶TE。

108、因为除数比被除数小3倍，所以商一定大3倍，答案是108

周长 = 4 个边长。

边长 = 400 4 = 100 米。

面积 s = 边长 x 边长 = 100 100 = 10,000 m2 = 1 ha。

边长为400 4=100，面积=100 100=10000平方米，10000平方米=1公顷。

边长 = 400 除以 4 = 100 米 100 乘以 100 = 10,000 平方米 10,000 平方米 = 1 公顷。 我希望你能采纳它。

边长 = 400 4 = 100 米。

面积 = 100 m * 100 m = 10,000 平方米 = 1 公顷。