在Western Blot中孵育一抗时，是否可以同时孵育多个一抗？

理论上是可以的，而且网上也看到一些网友声称他们已经这样做了。 然而，不同的一抗是否相容，以及它们应该添加多少，这些条件都需要专门探索和优化。 优化过程本身涉及分别采用每种一抗，以确定条带的位置以及在不受干扰的条件下特定样品中的背景。

所以除非这个实验 1对于房东来说，要大量实施，重复实施，找出大规模应用的条件; 或 2地主样品太珍贵了，得到的量不能用于多次免疫印迹实验，必须在一个膜上获得尽可能多的抗体结果，否则如果算上优化的精力和成本，一般不值得做。

可以同时孵育多种一抗，但有几点需要牢记：

1.确保使用的试剂和缓冲液不会与抗体发生交叉反应或干扰。

2.确保每次抗体孵育的条件和时间相同，避免抗体之间的不正当竞争。

3.在孵育多种抗体时，需要适当增加抗体的使用量，以确保每种抗体与其对应抗原充分结合。

4.在随后的洗涤步骤中，需要使用适当的洗涤缓冲液以避免抗体之间的交叉反应。

综上所述，可以同时孵育多种一抗，但需要注意保持孵育条件的一致性，避免抗体之间的交叉反应。

如果您的一抗是特异性的，是的。 最好将它们全部与相同的溶液混合，例如牛奶或 BSA

SDS-PAGE电泳前，将一般样品加入上样缓冲液中，煮沸5-10分钟，使蛋白质样品变性并携带一定电荷，使蛋白质迁移速率仅与分子量有关，从而通过电泳尽可能区分不同的蛋白质。 在这个过程中，一些分子相互作用，包括抗体和蛋白质样品之间的相互作用，被打断了，也许没有人这样做。

一抗是完全的蛋白质，如果与样品混合，即使是一抗在样品煮沸变性时也会分解成多肽，PAGE电泳后也会变成条带，完全失去作用。

我考虑了是否可以直接与蛋白质样品一起孵育，然后与二抗一起孵育，加入化学发光剂，然后在酶标仪中取一定量的样品进行分光光度法测量，并根据测量结果分析目标蛋白质的增加或减少。 我不知道这是否可以。 但这似乎已经成为ELISA实验的复杂版本......

然后你的一抗也会变性，二抗无法识别其空间表位。

当然，Western blot一抗孵育4小时是有效果的，一抗孵育时间过长容易导致非特异性吸附加深。

一般可在室温下孵育30分钟，再孵育4夜。 或者，选择将直接二抗在室温下孵育 2 小时。 由于洗涤膜会洗掉未结合的抗体，因此不容易洗掉抗体结合。

如果薄膜没有完全洗净，背景会很深，但延长的洗膜时间不会完全去除背景。

是的，一抗应该用封闭溶液稀释。 但是，请记住在将膜放入封闭溶液中之前用TBST清洗膜，以免残留的转移液影响抗原抗体结合。

根据你用来阻止它的东西，如果你使用5%的牛奶或1%的BSA，这是可以的。

相当于延长了一抗的孵育时间，一些二抗被过量的一抗结合浪费了，在二抗孵育清洗时，版本会因为一抗没有清洗，没有结合膜，但很可能应该与二抗结合的一抗不会接触与二抗或不均匀，导致条带不清晰和异常，以及强烈的非特异性背景。

没关系。 我已经这样做了，如果电泳很好，条带会可见，但整体亮度会更弱。 如果一抗没有问题，建议下次可以添加阳性蛋白作为对照，看看是否有问题。

祝你实验好运！

原则上二抗可以再次孵育而没有效果，但二抗一般孵育1-2小时就足够了，可能不会再变孵育，不知道怎么判断一抗没有问题。

将一抗孵育过夜。

操作：下班后 - 孵育一抗 - 将其放入4冰箱 - 第二天上班孵育二抗。

时间 8 到 10 小时，全部在线

将一抗在 4 度下孵育过夜 12 至 16 小时