蛋白质印迹法的工艺和原理

Western blot法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析物为蛋白质，将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品转移到固体载体中，电泳分离的肽类型及其生物活性可保持不变。

以固相载体上的蛋白质或肽为抗原，对应抗体进行免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，通过底物显色或放射自显影法检测经电泳分离的特异性靶基因所表达的蛋白质成分。

相关性如下。 原理：先制备蛋白质样品，然后利用SDS-PAGE原理分离不同的蛋白质，然后将分离出的蛋白质转移到膜上，以便将它们固定在新的膜上进行抗原抗体结合。

固定在膜上的蛋白质用作抗原，与相应的非标记抗体（一抗）结合。

由于在此过程中可能会残留一些不与抗原结合的抗体，因此需要清洁以保留特异性结合的抗原-抗体偶联物。 抗原-抗体偶联物暴露一个 FC 片段，相应的二抗可以与其结合形成抗原-一抗-二抗偶联物。

然后用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酶标记二抗，由于添加的标记物在质分子中比较大，可以通过离心沉淀，如果抗原和抗体结合，它们可以一起沉淀，最后可以通过显色反应或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分。

Western Blot的原理：简单来说，其原理是通过特异性抗体对用凝胶电泳处理的细胞或生物组织样品进行着色。 通过分析染色的位置和深度，可以获得有关所分析细胞或组织中特定蛋白质表达的信息。

Western blot，中文为Western blot，简称抗原-抗体特异性结合。

Western blot结果背景高的原因和建议：

膜封闭不足 – 延长密封时间; 选择更合适的封闭介质。 不适当的一抗稀释—测试抗体滴度以选择最合适的抗体稀释度。 一抗孵育温度偏高，建议结合过夜。

膜在实验过程中已经干燥，在实验过程中应注意保持膜湿润。 检测时间过长 - 缩短时间。

Western blot的原理如下：

蛋白质印迹是一种常用的蛋白质分析技术，它通过从复杂的蛋白质混合物中分离蛋白质并对其进行定量来确定蛋白质的存在和表达水平。 蛋白质印迹技术包括样品制备、蛋白质分离、转膜、蛋白质检测和分析等步骤。

1. 样品制备和蛋白质分离

首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白，通常使用细胞裂解和蛋白提取试剂盒来破坏细胞膜并释放蛋白。 然后通过离心等步骤纯化和富集提取的样品，以消除杂质和其他蛋白质的干扰。

2. SDS-PAGE凝胶电泳

根据蛋白质的分子量从样品中分离蛋白质是蛋白质印迹的关键步骤。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 通常用于此目的。 在SDS-PAGE中，通过电泳将蛋白质样品根据其分子量分离成条带，以使其通过凝胶迁移。

3.转移到胶片开始土地

SDS-PAGE分离完成后，需要将蛋白质从凝胶静静地转移到膜上，以进行后续的免疫测定。 此步骤称为电转印，通常使用半干式烘箱或湿式转印系统完成。

通过向蛋白质施加电流，蛋白质从凝胶转移到膜上。 常用的转印膜包括聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素膜。

4. 蛋白质检测与分析

将蛋白质转移到膜上后，需要进行蛋白质检测和分析。 第一步是阻断，即使用蛋白质结合抑制剂阻断膜上的非特异性结合位点，以避免免疫测定的背景干扰。 第二步是免疫测定，其中特异性抗体与目标蛋白结合，并使用标记的二抗或酶标记的抗体进行检测。

5. 结果分析和数据采集

蛋白质的存在和表达水平信息可通过蛋白质印迹法获得。 这可以通过观察免疫测定结果中的蛋白质带来判断。 使用成像系统（例如化学发光系统或紫外成像系统）获取图像，并使用图像分析软件进行量化。

蛋白质印迹

WB 是一种将电泳分离的组分从凝胶转移到固体载体（NC 或 PVDF 膜）并使用特定氨基酸序列特异性试剂作为探针进行检测的过程。 WB 使用抗体作为探针，该探针可以进行抗原抗体免疫反应，靶蛋白的表位附着在固体支持物上。 该技术的目的是鉴定和半定量从细胞或组织中提取的蛋白质混合物（即总蛋白质混合物）中的特定蛋白质，目的是鉴定特定蛋白质的类型（例如，亚型、mer、剪接体等）和蛋白质表达的变化。

基本流程如下：

我们已经介绍了SDS-PAGE，如果您想在电泳后进行蛋白质印迹，则需要转移膜。

转印：有两种不同的转印方法：湿式转印和半干式转印。 我采用半干转印法，用胶水覆盖膜，用平衡缓冲液（甲醇溶液）润湿膜，分别用顶部缓冲液和底部缓冲液润湿盖子，转移膜10min。

注：1：膜尺寸合适，防止浪费。

2：覆盖膜和凝胶后，凝胶和膜应压平，否则会导致转印不完全。

3：一定要戴上手套或塑料镊子接触薄膜，避免手上的蛋白质和油脂降低转印效率。

阻断：减少背景，占据膜上剩余的结合位点，使抗体只能与膜上的抗原特异性结合，一般使用5%的脱脂奶粉，但值得注意的是，对于磷酸化抗体或生物素化抗体，不能使用脱脂奶粉，只能使用5%的BSA。 封口时间：室温1-2h。

一抗孵育：封闭后，用PBST微洗膜倒出，然后加入PBST摇匀10min，洗涤3次后加入一抗+3%奶粉孵育2h，一般为5ml，但上次用的是10ml。 孵育一抗时，注意一抗的种类**，我用的是HIS标签，所以一抗是抗HIS的。

一抗可重复使用2-3次。

PBST解决方案 PBS解决方案与吐温。

洗膜：用PBST洗膜，10min次，洗涤3-4次。

二抗孵育：洗膜完成后，加入二抗+3%奶粉5ml，孵育1h，再次洗膜。 注意二抗的种类应该对应于一抗的**，例如，我的一抗是小鼠抗体，我的二抗是绵羊抗小鼠。

检测：将显影液中的液体A和液体B按1：1的比例吸收，混合在ml EP管中，100L一块胶水，然后将混合物均匀滴加在PVDF膜上，用塑料袋密封PVDF膜，放入显影剂中显影（速度要快，尽量减少基板消耗）。

蛋白质印迹实验的程序如下：

1.准备样品。

1）制冰并准备一个冰盒。

2）制备细胞裂解液：根据细胞数确定所需的裂解液：50ul六孔板和一孔。

裂解物配方：100ul碧云田裂解物+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ulpmsf

3）根据实验需要制备细胞：取出培养基，用1PBS洗涤3次（从培养基中取出血清），向每个孔（6孔板）中加入适量的裂解液。快速刮掉细胞并将它们转移到试管中，放在冰上20分钟，摇晃并混合，然后在冰上再放置10分钟。

2.SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳：制备分离凝胶（5ml凝胶）。

3.膜转移。

1）切开胶水，根据记号笔的说明书和靶带的位置切开胶水（注意胶水的边角有标记），将洗脱后的胶水浸入转印缓冲液中15分钟。

2）PVDF膜打标后，将其浸入甲醇中1分钟，然后与4张3mm滤纸和海绵一起浸入转印缓冲液中浸泡15分钟。

组织（小鼠十二指肠）蛋白提取。

制备方法：研磨珠、离心管、生理盐水、RIPA蛋白裂解物、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂、移液枪、吸头、手套、冰、涡旋仪、离心机4台;

将蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂加入到RIPA蛋白裂解物中（根据说明书确定添加量）。

2.研磨：将RIPA蛋白裂解物300 L提前分装在离心管中，放入2个研磨珠中，称取样品约100mg，置于均质器中充分研磨;

3.蛋白质裂解：将样品在冰上裂解2小时，在此期间在涡旋振荡器**上裂解2-3次;

4.蛋白质收集：将裂解的样品以4 12,000rpm离心10分钟，取上清液并将其放入新的EP管中以备后用。

蛋白质印迹法的处理过程如下：

1. 收集蛋白质样品制备

细胞裂解物用于裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。 然后测定每个蛋白质样品的蛋白质浓度。

2. 电泳

1）SDS-PAGE凝胶制备。SDS-PAGE凝胶（分离凝胶和堆积凝胶）可以参考一些文献来制备。

2）样品处理。向采集的蛋白质样品中加入适量的浓缩SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。 例如，2x 或 5x SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。

3. 转让

1）我们建议使用PVDF膜进行蛋白质实验。也可以使用硝酸纤维素膜（NC膜），但硝酸纤维素膜在操作过程中易碎，特别是在镊子时容易开裂。 请参阅制造商推荐的膜使用程序。

通常，如果使用 Bio-Rad 的标准湿式传输单元，传输电流可以设置为 300-400mA。

2）在转膜过程中，特别是大电流快速转膜时，通常会出现非常严重的发热现象，最好将转印槽放在冰浴中进行转膜。在所使用的预染蛋白分子量标准中可以观察到转移的效果，并且通常很难将分子量最大的1-2条带全部转移到膜上。 转印膜的效果也可以与Ponceau一起使用。