蛋白质含量测定不同方法的比较

蛋白质含量测定是生化研究中最常用和最基本的分析方法之一。 目前常用的古代经典方法有四种，分别是氮测定法、双收缩尿法（缩二脲法）、福林酚试剂法（Lowry法）和紫外线吸收法。 还有一种在过去十年中才被普遍使用的新检测方法，即考马斯亮蓝法（布拉德福德法）。

其中，Bradford法和Lowry法的灵敏度最高，比紫外线吸收法灵敏度高10 20倍，灵敏度比Burine法高100倍以上。 虽然氮测定方法比较复杂，但更准确，用氮测定法测定的蛋白质常被用作其他方法的标准蛋白质。

需要注意的是，这最后四种方法不适用于任何条件下任何形式的蛋白质，因为对于由这四种方法确定的蛋白质溶液，可以给出四种不同的结果。 每种检测方法都不完美，各有优缺点。 选择方法时，应考虑：

测定所需的灵敏度和精密度; 蛋白质的性质; 溶液中存在的干扰物质; 确定所需的时间。

考马斯亮蓝法（布拉德福德法）由于其突出的优点而得到越来越广泛的应用。

1.凯氏定氮法测定法。

凯氏定氮法由丹麦开发。

由化学家凯达尔于1833年创立，现已发展成为恒定、微观、平坦和微观凯氏定氮法和自动定氮法，是分析有机化合物氮含量的常用方法。

凯氏定氮法基于这样一个事实，即蛋白质中的氮含量通常约为其总质量的 16%，因此可以通过测量物质中的氮含量来估计物质中的总蛋白质含量（假设被测物质中的所有氮都来自蛋白质），即， 蛋白质含量 = 16% 氮含量。

2.紫外吸收光谱。

紫外吸收光谱法，也称为紫外分光光度法，是基于紫外光的不同波长，具体取决于物质。

一种分析具有不同吸收程度的物质组成的方法。 该方法使用的仪器是紫外吸收分光光度计。

或紫外-可见吸收分光光度计。

光源发出的紫外线。

通过光栅或棱镜进行光谱分析后，分别通过样品溶液和参比溶液投射到光电倍增管上，经过光电转换和放大后，紫外吸收光谱可用于物质的定性分析。

蛋白质的测定方法可分为两类：一是利用蛋白质的共性，即氮含量、肽键和折射率来测定蛋白质含量; 另一种是利用蛋白质中特定的氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香族来测定蛋白质含量。 常见的方法有：

凯氏定氮法、缩二脲法、苯酚试剂法和紫外线吸收法。

1.凯氏定氮法。

制备4个50ml凯氏定氮烧瓶并贴上标签，将定量蛋白质样品加入烧瓶中，另外两个烧瓶作为对照，每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，然后加入浓硫酸，将4个烧瓶放在消化架上进行消解，然后进行蒸馏，蒸馏完毕后，用标准盐酸滴定每个烧瓶中收集的氨的量，直到指示剂混合物由绿色变回淡紫红色，这是滴定的终点，蛋白质含量沉淀。

2.利脲法。

利脲法首先通过比色法测定蛋白质浓度，硫酸铵不干扰显色，Cu2+与蛋白质的肽键以及酪氨酸残基络合形成紫蓝色络合物，在540 nm处吸收最大。 首先，用标准蛋白溶液和缩二脲试剂绘制标准曲线，将待供试血清与试管中的硫酸钠混合，以仅含硫酸钠而不含血清的试管为对照，将两个试管加入等量的缩二脲试剂中， 充分混合，置于37环境中10分钟，在540nm波长下进行比色法，对照管归零，读取吸光度值，直接从标准曲线检测蛋白质含量。缩二脲法常用于测定蛋白质溶液的含量。

3.酚类试剂法。

取6支试管并分别标记，前5支试管加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加入待供测蛋白质溶液，不加入标准蛋白溶液，加入蒸馏水使每支试管中的液体总量一致， 将液体混合均匀，室温放置30分钟，以第一试管无蛋白溶液为空白对照，在650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4.紫外线吸收。

大多数蛋白质在280nm波长处具有特征性的最大吸收，这是由于蛋白质中存在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，可用于确定蛋白质溶液的含量。 取9个试管分别标记，前8个试管加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加入标准蛋白溶液，最后一个试管加入待供测蛋白质溶液，不加入标准蛋白溶液，加入蒸馏水使每个试管中的液体总量保持一致， 将液体混合均匀，在280nm波长下进行比色，并记录吸光度值。

5.其他。 除上述方法外，考马斯亮蓝法和地喹啉羧酸法也可用于蛋白质测定。

凯氏定氮法原理：蛋白质平均含氮量为16%。

当样品与浓硫酸共热时，蛋白氮转化为铵盐，氨在强碱性条件下蒸发，用指示剂用硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，蛋白质中的氮含量和蛋白质含量可以通过标准酸的量来求。

蛋白质浓度由布拉德福德法测定。

1）实验原理。

缩二脲法和亚叶酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多局限性促使科学家寻找更好的鸡蛋。

白质溶液的测定方法。

考马斯亮蓝法（布拉德福德法）由布拉德福德于1976年建立，是根据蛋白质结合染料的原理设计的。 这种蛋白质。

质量检测被广泛使用，因为它们比其他几种方法具有突出的优势。 这种方法是目前最灵敏的蛋白质测定方法。

法律。 考马斯 G-250 染料与酸性溶液中的蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（最大）的位置从 465nm 变为 595N

M，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。

吸光度值A595在595nm处测定，与蛋白质浓度成正比。

布拉德福德方法的突出优点是：

1） 灵敏度高，估计比 Lowry 方法高约 4 倍，最小蛋白质检测体积高达 1 g。 这是因为蛋白质是在与染料结合时产生的。

颜色变化很大，蛋白质染料复合物具有较高的消光系数，因此与Lowry法相比，吸光值随蛋白质浓度的变化更大。

多。 （2）测定快速简便，只需添加一种试剂。 只需约5分钟即可完成样品的测量。 由于染料与蛋白质结合。

该过程大约需要 2 分钟才能完成，颜色稳定 1 小时，在 5 分钟到 20 分钟之间，颜色稳定性最好。

因此，不需要像 Lowry 方法那样耗时且严格的时间控制。

3）干扰物质少。例如，K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰Lowry方法。

干扰该测定。

1.凯氏定氮法测定法。

凯氏定氮法由丹麦化学家凯德尔于1833年创立，现已发展成为恒定、微量、平整和微量凯氏定氮法和自动氮素测定法等，是分析有机化合物氮含量的常用方法。

凯氏定氮法基于这样一个事实，即蛋白质中的氮含量通常约为其总质量的 16%（12% 至 19%），因此可以通过测量物质中的氮含量来估计物质的总蛋白质含量（假设被测物质中的所有氮都来自蛋白质）， 即蛋白质含量=氮含量16%。

2.紫外吸收光谱。

紫外吸收光谱法又称紫外分光光度法，是一种根据不同波长的紫外吸收程度来分析物质成分的方法。 该方法中使用的仪器是紫外吸收分光光度计或紫外-可见吸收分光光度计。

光源发出的紫外光经光栅或棱镜分隔，然后分别通过样品溶液和参比溶液投射到光电倍增管上，经过光电转换放大后，绘制出的紫外吸收光谱可用于物质的定性分析。

测定蛋白质含量的常用方法如下：

1.凯氏定氮法是一种通用的蛋白质定量方法，可以测定氮含量，甚至可以测定微量有机氮，在测定蛋白质含量方面操作简单，检测效率高，GET准确率高。 该方法以氢气为氮源，氨与硫酸一起释放，氨碱中的氨与硫酸钠一起携带，然后缓冲和蒸发水解，最后通过苯酚酿造定量氮气，形成深蓝色络合物，从而间接得到蛋白质含量。

2.Bradford法也是一种多用途方法，可直接测定蛋白质中的色氨酸和胆红素含量，该方法操作简单，成本低，测试效率高，可在一小时内获得高精度的测量结果。 布拉德福德方法基于蛋白质及其沉淀物与二价铬 J 复合物结合的原理，从而形成光电特异性比色反应。

3.洛瑞法也是一种多功能定量法，该法可以测定有机物中蛋白质、氨基酸等氮的氮含量，以及各种物质中的亲和菌，操作过程简单，准确率也高，比凯氏定氮法快7倍以上，洛瑞法的原理是将蛋白质分解成氨基酸， 通过色色比色反应，将基材络合工艺为芦苇磨自络金属，再经冷酰菌素处理，在酰基腾中形成颜料降解形成比色荧光，定量检测氮含量。从而间接获得蛋白质含量。