PCR加载的顺序是什么？

水、缓冲液、镁、引物、模板、dntp、聚合酶。

一般来说，镁、引物、模板、dntp在四个阶上无关紧要，最后应添加酶，先加入水和缓冲液。

最后应添加酶，应先添加水和缓冲液。

没有顺序，最后加酶就行了。

实验处理注意事项 虽然扩增序列的残留污染主要是由于假阳性造成的，但样品之间的交叉污染也是一个原因。 因此，不仅在进行扩增反应时要谨慎和认真，而且在样品采集、提取和扩增的各个方面都要小心谨慎

1.戴上一次性手套，如不慎溅到反应液，应立即更换手套;

2.使用一次性吸头时，严禁在PCR产物分析室与吸头混合使用，吸头不宜长时间暴露在空气中，以免气溶胶污染;

3.为避免反应液飞溅，为避免这种情况，在打开反应管时，在打开盖子之前稍微离心，以收集管底部的液体。 如果您不小心溅到手套或桌面上，请立即更换手套并用稀酸擦拭桌面;

4.处理多个样品时，配制反应混合物，先将DNTP、缓冲液、引物和酶混合，再分装，这样可以减少操作，避免污染，提高反应的准确性;

5.最后加入反应模板，加完后将反应管盖紧;

6.建立阳性和阴性对照和空白对照，不仅可以验证PCR反应的可靠性，还可以帮助判断扩增系统的可靠性。

7.尽可能使用可互换或可高压灭菌的注射器，因为注射器最容易受到产品气溶胶或标本DNA的污染，因此最好使用可以在不同或高压下处理的注射器。 如果没有这种专用的进样器，至少进样器在PCR操作时应该是专用的，不能交叉使用，特别是用于PCR产物分析的进样器不能用于其他两个区域;

8.重复实验，验证结果，仔细得出结论。

1.模板的材料主要以PCR增加对象为主，可以是病毒等病原体标本，也可以是细胞等病理生理标本。

2.标本处理的基本要求是去除杂质，对标本中的核酸进行部分纯化。 大多数样品用SDS和蛋白酶K处理。 难以破碎的细菌可以用溶菌酶加EDTA治疗。

3.引物最好设计在模板cDNA的保守区，引物长度一般在15-30个碱基之间，引物长度通常采用为18-27 bp，但不应大于38，因为太长会导致其伸长温度大于74， 不适用于Taq DNA聚合酶反应。

4.引物的GC含量在40%-60%之间，TM值应接近72，GC含量过高或过低不利于引发反应。 上下游引物的TM值为寡核苷酸的熔解温度，即50%的寡核苷酸双链在一定盐浓度下解冻的温度。

5.引物的3'端应避免密码子的第3位，引物的3端不应终止于密码子的第3位，引物的第3端不能选择A，最好选择T，当引物的3端不匹配时， 不同碱基的起爆效率差异很大。<>

PCR实验：

1.DNA变性（90-96）：在热作用下，双链DNA模板的氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火（复性）（40-65）：体系温度降低，引物与DNA模板结合形成局部双链。

3.延伸（68-75）：在Taq酶的作用下（最佳活性在72左右），以DNTP为原料，从引物的5端和3端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每个循环都经过变性、退火和拉长，DNA含量增加一倍。

语言DNA的半保存复制是生物进化和传代的重要途径。 双链DNA在多种酶的作用下可以变性并展开成单链，并在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对的原理将其复制到相同的双分子拷贝中。

在实验中发现，DNA在高温下也可以变性分解，在温度降低时可以重新折叠成双链。 因此，通过温度变化控制DNA的变性和重性，DNA聚合酶和dNTP可以通过添加设计引物完成特定基因的体外复制。

然而，DNA聚合酶在高温下会失活，因此，每个循环都必须添加新的DNA聚合酶，这不仅操作繁琐，而且价格昂贵，这限制了PCR技术的应用和发展。

一般来说，东西的添加是按照从大体积到小体积的顺序进行的，这样样品才准确。 小体积往往会粘在管头上，因此最好在溶液或介质上轻轻吹气。 水的体积一般最大，先加。

酶很容易变性，因此应在冰盒中操作并在最后添加。 其他订单是愿意的。

高温变性 – 低温退火 – 底漆延伸。

样品制备、PCR 和凝胶电泳检测。

实验方法的原理。

模板DNA变性：将模板DNA加热到94左右一定时间后，将PCR扩增形成的模板DNA双链或双链DNA解离成为单链，从而与引物结合，为下一轮反应做准备;

模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

引物延伸：DNA模板--引物偶联物在Taq酶的作用下，以DNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保留复制的原理，合成了与模板DNA链互补的新的半保留复制链。

通过重复变性-退火-延伸这三个过程的循环，可以获得更多的“半保留复制链”，这个新的链可以成为下一个循环的模板。 完成一个周期需要 2 到 4 分钟，2 到 3 小时将要扩增的基因扩增数百万倍。

典型的PCR包括三个步骤：高温变性、低温退火和中温延伸，通过连续循环这一过程，DNA可以扩增数百万倍。

方法。 在冰浴中，按以下顺序将组件添加到无菌离心管中。

10×pcr buffer

5 μl dntp mix （2mm）

4 L 底漆 1（晚上 10 点）。

2 L 底漆 2（晚上 10 点）。

2 L Taq 酶 （2 U L）。

1 L DNA 模板 （50 ng-1 g L） 1 L 加 DDH2O 至 50 L

根据PCR仪器是否有热盖，不添加或添加石蜡油。

请点击输入描述。

调整反应程序。 离心混合物并立即将其放在PCR仪上进行扩增。 常规：

在93预变性3-5分钟时，进入循环扩增阶段：93 40s 58 30s 72 60s，30-35 个循环，最后在 72 保持温暖 7 min。

请点击输入描述。

在反应结束时，将PCR产物放置4年，通过电泳检测或-20年储存。

请点击输入描述。

PCR电泳检测：反应管中加入石蜡油时，用100L氯仿提取反应混合物，除去石蜡油; 否则，直接取5-10L电泳。

end<>

请点击输入描述。

类似于DNA的自然复制过程。 它由三个步骤组成。

模板DNA变性：模板DNA经过一定聚合酶链式反应后加热至90 95，将PCR扩增形成的模板DNA双链或双链DNA解离成为单链，从而与引物结合，为下一轮反应做准备;

模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA加热变性成单链后，温度降至55 60，引物与模板DNA单链的互补序列配对;

引物延伸：DNA模板-引物偶联物在DNA聚合酶的作用下，于70 75年，以DNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保留复制的原理，合成了与模板DNA链互补的新的半保留复制链。

PCR的一般过程是什么？

原理：DNA的复制。

工艺：1变性 2复性（退火） 3扩展。