使用前如何处置HPLC级流动相的简要说明

用流动相稀释样品的主要目的是提高分离度，增加理论板的数量，使峰形尖锐对称。 具体原因如下：

色谱的本质是样品在流动相和固定相之间反复分布的过程，在实践中会受到许多因素的影响，导致分离度下降，理论板数减少，分离效果不理想。

根据液相色谱范德姆特方程h=a+c（a为涡扩散系数，c为传质阻抗系数，为流动相流速）。

涡流扩散主要是由色谱柱本身引起的。

传质阻抗是阻碍分子为实现固定相和流动相之间的平衡而吸附、解吸、溶解和扩散的因素。 在理想状态下，如果色谱柱的传质阻抗为零，则组分分子流动相与固定相之间的平衡将迅速达到，并且在实际系统中传质阻抗不会为零。 用流动相溶解稀释后的样品的目的是降低传质阻抗，增加分离板的数量，使峰尖锐对称。

反相高效液相色谱的固定相为非极性溶剂，常用固定相为十八烷基键二氧化硅，常用相为极性溶剂，常用流动相为甲醇和乙腈。

反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相组成的液相色谱系统，与极性固定相和弱极性流动相（正相色谱）组成的液相色谱系统相反。

RP-HPLC的典型固定相是十八烷基键合二氧化硅，典型的流动相是甲醇和乙腈。 RP-HPLC是当今液相色谱最主要的分离方式，可用于分离几乎所有可溶解在极性或弱极性溶剂中的有机物。 反相色谱适用于非极性、极性或离子化合物的分离，大部分分析任务由反相色谱法完成。

高效液泉相色谱法。

流动相的基本要求是：

1）待测样品的溶剂。必须具有正确的极性和良好的选择性。

2）应更换溶剂以匹配检测器。对于紫外吸收检测器，应注意检测器的波长比溶剂的紫外截止波长长。 所谓溶剂的紫外截止波长，是指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对这种辐射的吸收性很强，认为溶剂是光学不透明的，严重干扰了组分的吸收测量。

对于折光率检测器，必须选择与组分折光率相差很大的溶剂作为流动相，以达到最高的灵敏度。

3）纯度高。由于高性能液相的高灵敏度，对流动相溶剂的纯度也提出了要求。 不纯的溶剂会导致基线不稳定，或产生“虚假峰”。 痕量杂质的存在将使截止波长值增加 50 ioonm。

1.流动相恢复到室温后使用。 当流动相的温度与室温不同时，流动相在恢复到室温之前很难稳定基线水平，特别是发生漂移和容易产生气泡的情况。 当水与有机溶剂混合时，混合物变化很大，并且经常与室温相差很大，因此需要注意。

2、HPLC流动相试剂应为HPLC级，水应用二次蒸馏水蒸馏，水性流动相应经常更换，防止长菌变质。 不适合使用去离子水、注射水和纯净水（用于烹饪），尤其是在梯度洗脱时，因为水中的杂质会变成鬼峰并干扰分析结果。

3、流动相pH值过高或过低，流动相使用纯水，使用高浓度磷酸盐缓冲溶液，使用离子对试剂等，都可能导致色谱柱填料发生化学破坏，对色谱柱固定相和键合相的损坏通常是无法修复的。

4、使用缓冲盐作为流动相时，使用前后用水清洗流路，绝对禁止将缓冲溶液留在流路中静置或长时间放置。

5.更换两个不相容的流动相时，中间应用异丙醇溶液清洗过渡液。 例如，先用甲醇水作为流动相，再用正己烷作为流动相时，一定要先用异丙醇溶液冲洗甲醇水，再用正己烷冲洗异丙醇，反之亦然。

还要考虑更换流动相时是否会更换色谱柱。

HPLC中使用的流动相必须提前脱气，否则气泡很容易在系统中逸出，影响泵的运行。 气泡也会影响色谱柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使其无法检测。

噪音增加，基线不稳定，突然跳跃。 此外，溶解在流动相中的氧气可以与样品、流动相甚至固定相（例如烷基胺）发生反应。 溶解气体还会导致溶剂pH值发生变化，从而导致分离或分析结果出现错误。

常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声波、吹氦等。

高效液相色谱是色谱的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输注系统，将不同极性或不同比例的单一溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱中，分离柱内各组分后， 他们进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。

复制脱气以摆脱流动。

相位中的气泡受到攻击，因此气泡不会干扰测量。

常用关。

反相是指流动相比固定相更具极性的液相色谱法。

反相中最常用的是C18色谱柱，最常用的流动相是乙腈、甲醇、水，还可以添加一些其他的东西，如磷酸盐、酸或胺类，也可以添加活化剂，视分析的需要而定。

使用液相色谱中使用的移动肢体时应注意以下问题

尽量使用高纯溶剂作为流动相，防止痕量杂质长期积累，损坏色谱柱，增加检测器噪声。 不纯的溶剂会导致基线不稳定并产生假峰。 避免流动相与固定相的相互作用，从而降低色谱柱效率，损坏色谱柱，如溶解固定溶液，氧化铝固定相被酸性溶剂破坏。

样品在流动相中应具有适当的溶解度，以防止沉淀和沉积在色谱柱中。 流动相具有低粘度（中等粘度）。 如果使用高粘度溶剂，压力会增加，不利于分离。 常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等。

但是，粘度过低的溶剂，如戊烷，也不适合使用，因为它们容易在色谱柱和检测器中形成气泡，影响分离。 良好的化学稳定性。 因此，流量满足检测器的要求。

对于紫外吸收检测器，应注意选择比溶剂的紫外截止波长更长的检测器波长。

所谓溶剂的紫外截止波长，是指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂会强烈吸收这种辐射，而溶剂被认为是光学不透明的，这可能会严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，需要选择组分折光率差异较大的溶剂作为透明流动相，以达到最高的灵敏度。

原则和分类

液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分亲和力的差异。 根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。 使用最广泛的是二氧化硅基液固色谱法和微硅基键合相色谱法。

根据固定相的形式，液相色谱法可分为柱层析法、纸层析法和薄层色谱法。 按吸附力可分为吸附色谱法、分割色谱法、离子交换色谱法和凝胶渗透色谱法。 近年来，由于在液柱色谱系统中增加了高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，提高了分离效果，因此出现了高效液相色谱。